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引物设计,PCR引物设计的基本原则是什么?

2022-4-23 09:06| 发布者: admin| 查看: 880| 评论: 0



1、引物设计:pcr引物设计的基本原则有哪些

2、引物设计:引物设计原则是什么?

2、引物设计:引物设计原则是什么?

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首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primerlength),产物长度(proctlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用?G值反映)。

形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(plexformationandhairpin)的能值,在错配位点(falseprimingsite)的引发效率,引物及产物的GC含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。

一、引物与模板的序列要紧密互补。

二、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

三、再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

3、引物设计:引物设计原则是什么?

3、引物设计:引物设计原则是什么?

引物设计原则是:

1、引物长度一般为15-,常用的为18-,但不能大于。

2、引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所对应的模板序列的Tm值**在72℃左右,至少要在55-80℃之间,Tm值曲线以选取72度附近为佳,5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合。

4、ΔG值(自由能)反应了引物与模板结合的强弱程度,3'端的ΔG值相对要低,且**值不要超过9,否则不利于正确引发反应,3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,但在-6时只达到40%,-8时少于20%,-10时接近于0。

5、错配率一般不要超过,否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为以上,而在错误位点的引发效率为,并且不好找到其他更合适的引物,那么这对引物是可以接受的。

4、引物设计:引物设计中的F、R表示什么?

4、引物设计:引物设计中的F、R表示什么?

正向引物,反向引物。

引物自身及引物之间不应存在互补序列。连续互补的碱基应该要少于4个。引物应使其G值不要太高,G值越大,则双链越稳定。

引物长度和GC含量要适中。引物长度大概为18~,但不应大于,引物过短会影响到扩增的特异性,太长的话其延伸温度将会大于74℃,不利Taq酶的催化反应。若扩增产物为4~5kb,引物**不要少于。

注意事项:

1、引物的长度一般为15-30?bp,常用的是18-27?(22)bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq?DNA聚合酶进行反应。?

2、碱基要随机分布:引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False?priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布**是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

3、3′端不应超过3个连续的G或C,如GGG或CCC,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

4、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

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